| 第1章 疾患プロテオミクスの基礎 |
| 1． |
疾患プロテオミクスとは何か （戸田年総）
要旨なし |
| 2． |
プロテオミクスによる疾患研究と臨床診断へ向かう新戦略 （戸田年総・荒木令江）
プロテオミクスは，既に多くの生命科学研究領域で利用されており，基礎研究の分野では様々な成果が上がってきている。とりわけタンパク質の機能的な変化が発症の原因になっているであろうと考えられている疾患の研究においては，従来のゲノムの解析だけでは得られないタンパク質発現レベルでの異常を，網羅的にスクリーニングするための手法として期待されている。プロテオミクスによる疾患研究は，疾患マーカーを探索し病態の機序を明らかにする段階を経て，新たな検査診断システムの構築へと進み，治療や創薬標的の探索を経て最終的にはベッドサイドでの臨床応用にまで進むものと思われる。
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| 3． |
病態プロテオミクスと創薬―国内外の動向― （藤田芳司・劉 世玉）
すべての患者にとって，「正確な診断（できれば早期に）」，「患者ごとの体質・症状に合った治療法の選択」，「選択した治療効果の検証」は将来の医療に対する最低限の要求である。プロテオミクスは創薬ターゲットの探索，疾患のメカニズムや薬剤の作用機序の解明，および薬効・副作用と相関するバイオマーカーの同定に重要な役割を担っている。プロテオミクス以前の古典的手法でも数千個以上もの生理活性有用タンパク質（創薬のターゲット）が見出されてきたが，技術革新に伴い，新規タンパク質の発見はさらに加速されよう。それらの中から診断マーカーが仮に特定できたとしても，実際に臨床応用できるようにするには，バリデーション，ブラインドテストなど，多段階のステップを必要とする。最近注目されている技術として，タンパク質-タンパク質間相互作用の解析に用いられるCellzome社のTAP技術があげられる。また，特定の細胞内情報伝達系の活性化を調べることで，薬剤の作用機序を解明するのであれば，遺伝子発現とタンパク質発現を同時に測定できるACLARA社の技術が有用であると考えられる。腫瘍マーカー，副作用マーカーなどのタンパク質が同定されると，抗体を作製してアッセイ方法を開発するのが一般的であったが，効率性，検出感度や特異性などの面で十分とはいえない。SomaLogic社のアプタマー技術はこれらの欠点を改善しており，注目に値するといえよう。 |
| 第2章 臨床プロテオミクス研究を支える基礎技術、最新解析法 |
| 1． |
プロテオーム解析技術−現状と課題− （平野 久）
ポストゲノム時代に入り，ゲノム解析の成果を活かしてプロテオームを構成する多数のタンパク質の機能や機能的なつながりを網羅的にハイスループットで分析するプロテオーム研究，なかでも病態に関わるタンパク質を同定し，その機能や機能ネットワークを分析する疾患プロテオーム研究への関心が高まっている。プロテオーム研究で用いられる質量分析を中心としたタンパク質同定の技術，多数のタンパク質の機能を解析するためのタンパク質の動態，翻訳後修飾，タンパク質間相互作用を分析する技術の現状と課題について述べる。
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| 2． |
レーザーマイクロダイセクションとプロテオーム解析 （近藤 格）
生体の組織内には様々な細胞が存在し，各々独自のプロテオームを持っている。従って，正確なプロテオーム解析のためには，タンパク質を抽出する前にあらかじめ細胞を単離する必要がある。筆者は超高感度の蛍光色素を用いて，レーザーマイクロダイセクションで単離された腫瘍細胞のプロテオーム解析を行っている。蛍光色素で標識されたタンパク質を二次元電気泳動で分離すると，定量性に優れたプロテオーム情報を得ることができる。レーザーマイクロダイセクションは，病理組織像とプロテオミクスをつなげるツールとして極めて重要である。 |
| 3． |
Proteomic Differential Displayの最前線 （荒木令江・長 経子・青木雅史）
よりよい臨床マーカーや治療ターゲット，創薬開発などの臨床応用や細胞機能解析への基礎情報とするため，異なる状態にある組織や細胞や体液から抽出したタンパク質群を相互比較して，特異的に発現・上昇する，あるいは減少・消失するタンパク質群を網羅的に検出して定量的に同定する一連の解析法をproteomic
differential
display（タンパク質定量的差異解析法）と呼んでいる。疾患関連タンパク質の多くがこの方法を用いて発見され，既に臨床応用されたり，活用されようとしている。一般に，mRNAにおけるdifferential
display法はDNAアレイやreal time
PCRなどの開発によって，非常に簡易で高感度，かつハイスループットに利用されるようになったが，proteomic
differential
解析においても，ここ数年で数々の新しい方法論が開発され，感度，定量性，処理能力の面で格段の進歩があった。本稿では，いまだmRNAレベルまでには到達していないまでも，現在進行形で開発が進んでいるproteomic
differential
display法の中で，特に感度と定量性を向上させるために開発されたタンパク質標識試薬を用いた二次元differential
電気泳動法（多次元蛍光標識法：2D-DIGE，蛍光色素染色法），およびLCショットガン法（安定同位体
in vivo 標識法，in vitro
標識法：cICAT法，iTRAQ法）による定量的proteomic differential
display法の原理と解析の現状・問題点を中心に紹介する。 |
| 4． |
二次元電気泳動の最前線 （大石正道・土橋香織）
二次元電気泳動（2-DE）法は数千種類のタンパク質を同時に分析できるため，発現プロテオミクスでは，①細胞や組織における各タンパク質の発現量の違いを比較する場合や②同定用のタンパク質を調製する場合などに利用される。ここでは，O'Farrellの2-DE法，固定化pH勾配ゲルを用いたイモビライン法，高分子量タンパク質の解析に適したアガロース二次元電気泳動（アガロース2-DE）法，蛍光標識二次元ディファレンシャルゲル電気泳動（2D-DIGE）法を取り上げ，各々の特徴について紹介するとともに，2-DE法以外の方法との比較も行う。 |
| 5． |
二次元電気泳動法をベースとしたプロテオミクスの高感度化 （稲垣直之）
発現プロテオミクスの究極の目標は，組織や細胞に存在するすべてのタンパク質を検出して同定し解析を行うことであろう。細胞には，数万個以上のタンパク質が1〜105もしくは1〜106というダイナミックレンジで発現していると考えられている。そして，このように極めて広いタンパク質の発現ダイナミックレンジが，微量タンパク質を含むプロテオームの検出を困難にしている。本稿では，二次元電気泳動法をベースとしたプロテオミクスの高感度化に関して，プロテオーム検出カバー率の向上および分離した微量タンパク質の質量分析による同定率の向上の試みについて紹介する。 |
| 6． |
ショットガンプロテオミクス最前線 （田岡万悟・梶 裕之・山内芳雄・礒辺俊明）
最近，タンパク質を混合物の状態のまま酵素で消化して，生成したペプチドを高分離能のLCで分離して質量分析計で解析することで，混合物中のタンパク質を網羅的に同定・定量するショットガンプロテオミクス法がプロテオーム研究の様々な場面で利用されている。この方法では，細胞内に存在する機能性のタンパク質複合体やオルガネラなどの生物マシーナリーの構成成分を大規模に同定することが可能であり，その処理能力の高さから，生命科学の基礎研究だけでなく，創薬のための高度技術としても注目されている。 |
| 7． |
完全長ヒトcDNAを用いた大規模タンパク質ネットワーク解析 （夏目 徹）
多大な忍耐と労力を惜しまず，知恵と工夫を凝らし，一つ一つ取り組み研究を進めるのがこれまでのタンパク質科学であった。しかし，プロテオミクス技術の飛躍的な進歩に伴い，ゲノム科学がすでに実現した網羅的・包括的解析がタンパク質レベルであっても夢物語ではなくなったのである。マス・スペクトロメトリーの圧倒的な高感度化に伴い，「サンプルの調製」が分析の足枷とはならなくなった。本稿では，ヒト完全長cDNAプロジェクトの進捗とともに取得した1万6千にも及ぶ機能未知遺伝子のタンパク質相互作用をシステマティックに解析する試みの現状と可能性を展望する。 |
| 8． |
翻訳後修飾の解析 （山内英美子・谷口寿章）
タンパク質は生体内でリン酸，糖鎖，脂質などによる修飾，プロセシングなど様々な翻訳後修飾を受け，その機能，局在など様々な調節を受けている。このような修飾に異常が生じると，タンパク質の機能が正しく発揮されず，それが未知の各種疾患の原因になる可能性は高いと考えられる。一方，このようなタンパク質の修飾解析には，近年，質量分析が重要な解析技術として発展してきた。そこで本稿では，臨床プロテオミクス研究に応用が期待できる解析法の1つとして，質量分析を用いたタンパク質の翻訳後修飾の解析について，特にリン酸化修飾の解析を例に紹介する。 |
| 9． |
プロテインマイクロアレイの最前線 （横溝義男・原田最之・西村 紀）
プロテインマイクロアレイは，多数のタンパク質を固相基板上に格子状にスポットしたもので，一度に多数のタンパク質の動態をハイスループットに，しかも定量的に把握できるツールである。近年，プロテインマイクロアレイの作製に必要なタンパク質の作製技術，抗体のデザイン，基板および固定化技術などの重要な要素技術の改良や開発が急速に進み，プロテインマイクロアレイの診断，創薬，プロテオミクスへの利用が注目されつつある。本稿では，最近のプロテインマイクロアレイ作製技術とその応用について記述する。 |
| 10． |
膜上転写タンパク質の質量分析 （古田 大）
プロテオミクスはゲルベースでのpeptide mass
fingerprinting（PMF）解析を中心に展開してきたが，ケミカルプリンタの登場により，二次元展開したタンパク質を膜上で微小処理し，そのままダイレクトにMALDI-TOF
MS解析に導入することが可能となった。これにより1つのタンパク質スポットを独立した複数の解析に使用することができる。これは，希少なサンプル量に限定されるタンパク質解析を今後加速する有効なツールとなりうる。本稿では，この装置の機能について紹介するとともに，その代表的な応用例として転写膜上でのPMF解析の実際について述べる。 |
